如果能够建立识别单个蛋白质中单氨基酸分辨率的工具对于细胞生物学的研究将有巨大的推动作用。但目前能做得到的是对基因序列进行测序，但是无论是DNA基因组还是RNA转录组都不能带给我们对于蛋白质的全面认识，因为蛋白质中还包含翻译后修饰以及剪接相关的信息。因此，在单分子水平上能够直接将蛋白质测序并检测翻译后修饰的稳健方法将极大地有利于蛋白质组学的研究，促进对于低丰度蛋白以及翻译后修饰分布的检测。为此，荷兰代尔夫特理工大学研究组在发文题为，Multiple rereads of single proteins at single-amino acid resolution using nanopores，提供了一种基于纳米空测序的单分子蛋白阅读器，可以以高保真度和高通量区分单个蛋白质在单一氨基酸分辨率下的信息。
纳米孔测序是一种单分子DNA测序技术，该技术能够在便携式平台上以最小的成本长时间读取和检测表观遗传标记，最早起源于上世界80年代的几个实验室。在纳米孔测序中，纳米孔作为生物传感器提供了唯一的通道，使两种不同的离子溶液被电压为基础的膜给隔开，形成顺式一侧和反式一侧。分子通过纳米孔的时候在顺反两侧产生离子电流，通过聚合酶或者解旋酶与多核苷酸紧密结合，逐步控制核苷酸通过纳米孔，不同碱基产生不同的电流，从而读出核苷酸序列。因此，纳米孔最窄的孔径区域就是其传感区域，通过纳米孔和沿着核苷酸行走的解旋酶，促使DNA以一个一个碱基的方式通过纳米孔。
图1 纳米孔技术
有人曾经提出假设，可以利用纳米孔技术对蛋白质也进行单个氨基酸的测序，研究表明小肽片段通过纳米孔自由转运的方式可以对单个氨基酸表现出敏感性，但是目前尚缺乏地确定氨基酸顺序以及重建蛋白质序列的方法。为此，作者们。该链由一条80个核苷酸的DNA链组成，通过叠氮化合物修饰共价链接一个26氨基酸的合成肽，该肽段中富含带负电的氨基酸比如天冬氨酸和谷氨酸，这样通过电渗力将多肽拉过纳米孔。纳米孔使用的突变型的MspA，具有杯子的形状，可以将解旋酶从离子电流阻塞的孔收缩过程中分离出约10 nm。对于DNA易位动力蛋白酶，作者们使用的是Hel308 DNA解旋酶。使用该解旋酶是因为通过MspA拉动DNA单链每次的长度是0.33nm，刚好是单个氨基酸的步长，另外该解旋酶比较稳定且能够耐受高盐，而且其拉力大于50pN可以解开任何的靶标多肽的二级结构。
图2 通过纳米孔阅读单肽
作者们发现，类似于DNA序列的纳米孔读取，通过纳米孔的多肽会在离子流中产生一个独特的阶梯状模式。每次读取时离子电流步骤的持续时间各不相同，但水平序列信号特征具有高度的可重复性。通过建立识别软件，作者们可以准确识别电流信号，并对电流中值进行分析，从而回溯确认序列的信息。
图3 DNA-肽结合体通过纳米孔以及电流读数
进一步地，作者们想对该系统的精确性进行分析，因此作者们构建了不同的DNA-肽结合体，但是每个结合体中只改变某一个氨基酸，从而可以确认在单氨基酸改变的情况下该系统是否能够识别出不同。作者们发现电流信号在多个水平上具有差异，表明即使是单一氨基酸的替换也可以被该系统区分出来。为了定量评估对于多肽变异的可区分性，作者们进行了混淆矩阵的计算，发现可以以87%的平均准确率识别氨基酸变体。作者们发现通过连续控制解旋酶对同一分子进行多次独立的重新读取，可以消除导致纳米孔读取不准确的随机错误，从而大幅度提高纳米孔蛋白读取器的识别保真度。
但作者们对该方法的局限性也进行了分析，发现纳米孔可以能够顺利转运带有中性极性、非极性以及正电极性的氨基酸多肽，但是高正电荷的多肽易位转运的效率很有限。但幸运的是，通过对人类蛋白质组的分析显示，带负电荷的蛋白质序列比带正电荷的蛋白质序列更常见。
总的来说，该工作建立了能够以单氨基酸精度进行多肽测序的方法，不需要对设备进行重新的设计只需要改变样品制备和对电流信号进行数据分析的软件即可达到目标。该工具仍然保留了纳米孔进行DNA测序的特点，低成本、且对单个分子的微小物理变化非常敏感。该工作向着低成本蛋白质测序的迈出了新的一步，能够实现单细胞蛋白质组学研究，为基础生物学和临床中的应用提供了新的思路。
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381
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